(BALB/c-hPD1，C57BL/6-hPD1，BALB/c-hPD1/hPDL1，C57BL/6-hPD1/hPDL1)

PD1(programmed cell death 1)是程序性细胞死亡受体1，属于免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，是一种重要的免疫抑制分子，为CD28超家族成员。以PD1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植排斥反应等均有重要的意义。大量研究证实，肿瘤微环境中的肿瘤细胞表面PDL1表达量增高，同时与活化的T细胞上的PD1结合，传递负调控信号，导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡或功能衰竭，从而抑制免疫反应，进而促使肿瘤细胞的逃逸。用抗体阻断PD1/PDL1信号通路已成为肿瘤免疫治疗的经典方法^[1-3]。

构建策略：集萃药康将BALB/c及C57BL/6小鼠的PD1细胞外部分替换为相应的人源片段，完整保留了小鼠PD1的胞内部分，成功构建了PD1单人源化小鼠模型，包括单人源化小鼠BALB/c-hPD1及C57BL/6-hPD1和双人源化小鼠模型BALB/c-hPD1/hPDL1及C57BL/6- hPD1/hPDL1。PD1人源化小鼠模型是人PD1抑制剂药效评价及安全性评价的理想动物模型。

1.BALB/c-hPD1：KEYTRUDA^®+ ENT联用药效实验

在BALB/c-hPD1小鼠皮下接种CT26.WT肿瘤细胞系后测试抗人PD1抗体KEYTRUDA^® (Pembrolizumab)单用及KEYTRUDA^®与HDAC小分子抑制剂Entinostat(ENT)联用的肿瘤抑制药效。

KEYTRUDA^®（Pembrolizumab）：默沙东公司上市抗肿瘤药物，抗人PD1抗体。

Entinostat (ENT): 是Syndax制药公司的I型 HDAC 选择性抑制剂，作用于HDAC1，HDAC2和HDAC3。

左图：小鼠肿瘤生长曲线  右图：小鼠体重变化曲线

基于BALB/c-hPD1小鼠皮下接种CT26.WT模型的体内联合用药实验。将对数生长期的结肠癌细胞CT26.WT接种至6-8周龄的BALB/c-hPD1人源化小鼠皮下，待肿瘤生长至平均体积约100 mm³时随机分Vehicle（对照）组，KEYTRUDA^®单药组，ENT单药组及KEYTRUDA^®+ENT联用组（n=7-9），并使用相应的药物进行治疗，KEYTRUDA^®：10 mg/kg；ENT：Entinostat，20 mg/kg。每3天给药1次，共给药6次。数据以Mean ± SEM形式呈现。

结果显示：KEYTRUDA^®或Entinostat单用时对肿瘤生长有抑制作用（KEYTRUDA^®治疗组TGI=45.3%，ENT治疗组TGI=44.6%）。KEYTRUDA^®和Entinostat联用时显示出比单用更强的肿瘤抑制药效（TGI=89.5%）（左图）。四组小鼠体重变化趋势接近（右图）。

结果证明：BALB/c-hPD1小鼠是评估抗人PD1抗体与其它药物联合用的体内药效的理想模型。

2.C57BL/6-hPD1：KEYTRUDA^®药效实验

在B6-hPD1小鼠皮下接种MC38肿瘤细胞系后测试不同剂量的抗人PD1抗体KEYTRUDA^®（Pembrolizumab）的肿瘤抑制药效。

KEYTRUDA^®（Pembrolizumab）：默沙东公司上市抗肿瘤药物，抗人PD1抗体。

 左图：小鼠肿瘤生长曲线  右图：小鼠体重变化曲线

基于B6-hPD1小鼠皮下接种MC38模型的体内药效试验(KEYTRUDA^®)。将对数生长期的小鼠结肠癌细胞MC38接种至6-8周龄的B6-hPD1人源化小鼠皮下，待肿瘤生长至平均体积约100 mm³时随机分为Vehicle（对照）组，KEYTRUDA^® 0.5 mg/kg组， KEYTRUDA^® 1 mg/kg组，KEYTRUDA^® 5 mg/kg组及KEYTRUDA^®10 mg/kg组（n=8），并使用相应剂量的药物进行治疗。每3天给药1次，共给药6次。数据以Mean ± SEM形式呈现。

结果显示：不同剂量的KEYTRUDA^®给药对肿瘤生长抑制程度不同，10 mg/kg组肿瘤抑制效果最明显（TGI=79.7%），剂量0.5 mg/kg，1 mg/kg及5 mg/kg三组肿瘤体积接近，TGI分别为44.7%，58%和56.2%（左图）。五组小鼠体重变化趋势接近（右图）。

结果证明： B6-hPD1小鼠是评估人PD1抗体药效的理想动物模型。

3.C57BL/6-hPD1：OPDIVO^®药效实验

在B6-hPD1小鼠皮下接种MC38肿瘤细胞系后测试不同剂量的抗人PD1抗体OPDIVO^® (Nivolumab)的肿瘤抑制药效。

OPDIVO^®（Nivolumab）：百时美施贵宝公司上市抗肿瘤药物，抗体人PD1抗体。

左图：小鼠肿瘤生长曲线      右图：小鼠体重变化曲线

基于B6-hPD1小鼠皮下接种MC38模型的体内药效试验（OPDIVO^®）。将对数生长期的结肠癌细胞MC38接种至6-8周龄的B6-hPD1人源化小鼠皮下，待肿瘤生长至平均体积约100 mm³时随机分为Vehicle（对照）组，OPDIVO^® 0.5 mg/kg组，OPDIVO^® 1 mg/kg组，OPDIVO^® 5 mg/kg组及OPDIVO^® 10 mg/kg组（n=6），并使用相应剂量的药物进行治疗。每3天给药1次，共给药6次。数据以Mean ± SEM形式呈现。

结果显示：不同剂量的OPDIVO^®给药对肿瘤生长抑制程度不同，10 mg/kg组肿瘤抑制效果最明显（TGI=95.0%），剂量0.5 mg/kg，1 mg/kg及5 mg/kg三组肿瘤体积接近，TGI分别为73.6%、66.6%和67.5%（左图）。五组小鼠体重变化趋势接近（右图）。

结果证明：B6-hPD1小鼠是评估人PD1抗体药效的理想动物模型。集萃药康的B6-hPD1对FDA已经批准的KEYTRUDA^®和OPDIVO^®均有响应。

 4. BALB/c-hPD1/hPDL1：KEYTRUDA®药效实验

在BALB/c-hPD1/hPDL1小鼠皮下接种CT26-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)肿瘤细胞系后测试抗人PD1抗体KEYTRUDA^®（Pembrolizumab）肿瘤抑制药效。

KEYTRUDA^®（Pembrolizumab）：默沙东公司上市抗肿瘤药物，抗人PD1抗体。

小鼠肿瘤生长曲线

于BALB/c-hPD1/hPDL1小鼠皮下接种CT26-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)模型的体内药效实验。将对数生长期的小鼠结肠癌细胞CT26-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO接种至6-8周龄BALB/c-hPD1/hPDL1小鼠皮下，待肿瘤生长至平均体积约100 mm³左右时随机分为PBS组，Keytruda(0.3 mpk)，Keytruda(1 mpk)、Keytruda(3 mpk)给药组 (n=8)，并使用相应的药物进行治疗，每周给药2次，共给药6次。数据以Mean ± SEM形式呈现。

结果显示： Keytruda(0.3 mpk)，Keytruda(1 mpk)、Keytruda(3 mpk)给药组的肿瘤体积抑制率（TGI）分别为43.49%、57.74%、64.67% 测试抗体均对肿瘤的生长有显著抑制作用，并具有一定的剂量梯度依赖。

结果表明：BALB/c-hPD1/hPDL1小鼠可以用来评价抗人PD1抗体、抗人PDL1抗体及联合给药的抗肿瘤作用。

5. C57BL/6-hPD1/hPDL1：KEYTRUDA®及TECENTRIQ®药效实验

在B6-hPD1/hPDL1小鼠模型皮下接种MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)肿瘤细胞系后测试抗人PD1抗体KEYTRUDA^®（Pembrolizumab）及抗人PD-L1抗体TECENTRIQ^®（Atezolizumab）肿瘤抑制药效。

KEYTRUDA®（Pembrolizumab）：默沙东公司上市抗肿瘤药物，抗人PD1抗体。

TECENTRIQ®（Atezolizumab）：罗氏公司上市抗肿瘤药物，抗人PD-L1抗体。

左图：Keytruda抗肿瘤药效；右图：Tecentriq抗肿瘤药效

基于C57BL/6-hPD1/hPDL1小鼠皮下接种MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO)模型的体内药效实验。将对数生长期的小鼠结肠癌细胞MC38-hPDL1(Tg)-mPDL1(KO接种至6-8周龄C57BL/6-hPD1/hPDL1小鼠皮下，待肿瘤生长至平均体积约100 mm³左右时随机分为Keytruda (1 mpk) 、 Keytruda (3 mpk) 、 Keytruda (10 mpk)、Tecentriq (1 mpk)、 Tecentriq (3 mpk)、 Tecentriq (10 mpk) 给药组(n=8)，并使用相应的药物进行治疗。每3天给药1次，共给药6次。数据以Mean ± SEM形式呈现。

结果显示：Keytruda (1 mpk) 、 Keytruda (3 mpk) 、 Keytruda (10 mpk) 给药组的TGI分别为79.63%、96.45%、99.52%；Tecentriq (1 mpk)、 Tecentriq (3 mpk)、 Tecentriq (10 mpk)给药组肿瘤体积抑制率（TGI）分别为48.26%、67.77%、88.52%，两种抗体均对肿瘤的生长具有显著的抑制作用，并具有一定的剂量梯度依赖。

结果表明：C57BL/6-hPD1/hPDL1小鼠可以用来评价抗人PD1抗体、抗人PDL1抗体及联合给药的抗肿瘤作用。

参考文献

[1] PD1 Blockade with Cemiplimab in Advanced Cutaneous Squamous-Cell Carcinoma. N Engl J Med. 2018, 26;379(4):341-351.

[2] PD1 makes waves in anticancer immunotherapy. Nat Rev Drug Discov. 2012, 11(8):601.

[3] Coexpression of Tim-3 and PD-1 identifies a CD8+ T-cell exhaustion phenotype in mice with disseminated acute myelogenous leukemia. Blood. 2011,117(17):4501-10.