可以在时间上调控基因的表达么？

可以的，诱导表达不但可以做到组织特异性，也就是空间特异性；还可以做到时间特异性。通常使用的时间上调控表达的方式一般有两种：

1）Tet-On/Tet-Off

Tet-on系统，rTTA在四环素存在的条件下，结合到TRE序列上，激活基因的表达。没有四环素的情况下，rTTA不结合TRE，基因保持关闭状态。

Tet-off系统，在没有四环素存在时，tTA蛋白持续作用于TRE启动子上，使基因持续表达。加入四环素时，四环素可与tTA结合使tTA蛋白的构象发生变化，使其不能与启动子结合，从而关闭基因的表达。

使用上述Tet-On/Tet-Off系统实时，需要建立两种表达框基序，一种是组织特异性或其它启动子控制的rTTA/tTA表达基序，另一种是TRE启动子控制的目的基因表达基序。可以将两种表达序列分别构建模型再进行配繁，或直接将两种表达序列构建到一个模型上。后来发现四环素类似物DOX的效果更好，目前通常使用DOX代替四环素开展实验。

图. Tet系统 [1]

tTA(tetracycline-dependent transactivator): 四环素依赖的反式激活因子；rtTA(reverse tetracycline-dependent transactivator): 反向四环素依赖的反式激活因子；DOX(doxycycline):强力霉素；TRE(Tet-responsive element):Tet响应元件。

2）loxP/CreERT2系统

雌激素受体突变型ERT2和Cre酶的融合，实现了目标基因的定时开启。在没有他莫昔芬的情况下，CreERT2与Hsp90结合在一起，被阻挡于细胞质内。在他莫昔芬存在的情况下，Hsp90解离出来，CreERT2与他莫昔芬结合，被转移到细胞核内，Cre酶识别loxP序列并发挥作用。

为了排除内源雌激素的影响，突变后的ERT2不再结合体内的雌激素，只对他莫昔芬这种外源药物有亲和力。同时，由于与Cre酶融合的只是雌激素受体的配体结合域，因此不会触发雌激素受体相应的基因调控。

图. CreER的诱导删除机制[2]

ER(estrogen receptor):雌激素受体的配体结合域；GOI(the gene of interest):目标基因

3）Tet-On/Tet-Off和loxP/Cre系统联用

Tet-On/Tet-Off和loxP/Cre系统联用，通过Dox调控Cre的表达，再通过Cre来调控目的基因的表达。

图. Tet-On/Tet-Off和loxP/CreERT系统联用[3]

参考文献：

[1] Palais G , Nguyen D C A , Friedman H , et al. Targeted transgenesis at the HPRT locus: an efficient strategy to achieve tightly controlled in vivo conditional expression with the tet system.[J]. Physiological Genomics, 2009, 37(2):140-6.

[2] BC Cox, Liu Z , Lagarde M , et al. Conditional Gene Expression in the Mouse Inner Ear Using Cre-loxP[J]. Journal of the Association for Research in Otolaryngology, 2012, 13(3):295-322.

[3] Hyeonhui K , Minki K , Sun-Kyoung I , et al. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes[J]. Laboratory Animal Research, 2018, 34(4):147.

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