细胞凋亡用(TUNEL，TUNEL染色)(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡检测试剂盒来检测。细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。细胞凋亡检测其原理是荧光素标记的12-dUTP在末端脱氧核苷转移酶(TdT)的作用下，连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3’-OH末端，利用由荧光显微镜或者流式细胞检测仪检测凋亡的发生。

　　tunel染色原理：

　　原理是荧光素(luorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdTEnzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3-OH末端，并与连接辣根过氧化酶(HRP，horse-radish peroxidase)的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色)，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本(石蜡包埋、冰冻和超薄切片)和细胞样本(细胞涂片)在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

　　tunel染色实验步骤操作流程图：

　　制作石蜡切片一脱蜡、水合一细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。

　　具体操作步骤(石蜡包埋切片的检测)：

　　1.用二甲苯浸洗2次，每次5min;

　　2.用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min;注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理

　　3.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21-37C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;

　　4.PBS漂洗2次;

　　5.制备TUNEL反应混合液，处理组用50lTdT+450ul荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50ul荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100ul DNase1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。

　　6.玻片干后，加50ul TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50ul荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。

　　7.PBS漂洗3次;

　　8.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm);

　　9.玻片干后加加50ul converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。11.PBS漂洗3次;

　　10.在组织处加50~100ulDAB底物，反应15~25℃×10min;

　　11.PBS漂洗3次;

　　12.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

　　13.加一滴PBS或山汕在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。

　　可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体)对丁培养细胞的预处理：

　　①在载玻片上铺层薄薄的多聚赖氨酸(见备注4)，干燥后在去离了水中漂洗，干燥后4℃保存;

　　②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片1，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上：

　　③将吸附细胞的载玻片在4%多聚甲醛(见备注2)中固定25min：④PBS浸洗二次，每次5min;

　　⑤将吸附细胞的载玻片在0.2%的TritonX-100(见备注5)中处理5min;

⑥PBS浸洗二次，每次5min;后续操作如同石蜡包埋切片的6-15