细胞传代名词解析：

　　细胞传代可以帮助我们扩大细胞培养的数量，同时也避免了因细胞进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。

　　细胞传代培养的原理：

　　传代培养中的细胞传代培养 (subculture)，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止; 另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。当培养的细胞增殖达到一定密度后，将会出现密度抑制现象，表现为细胞的生长和分裂速度逐渐减慢，甚至停止。此时如果不及时进行分装再培养，即传代培养，细胞将逐渐走向衰老、死亡。将培养的细胞从一个容器以 1∶2 或其他比率转移到其他容器中扩大培养，称为细胞传代培养。

　　细胞传代培养的方法:

　　1、贴附型生长细胞采用酶消化传代法。

　　2、悬浮型生长细胞则采用直接传代法或离心传代法。

　　细胞传代培养实验步骤：

　　一、贴附型生长细胞的传代

　　贴附型生长的细胞采用酶消化的方法进行传代。

　　具体步骤如下：

　　1. 细胞的清洗　取已长成或接近长成致密单层的 HeLa 或 T47D 细胞(或原代培养细胞)一瓶，倒去培养液，加入 2～3 mL Hanks 清洗液，轻轻振荡漂洗细胞后倾去清洗液，以去除残留的培养液和衰老脱落的细胞及其碎片。

　　2. 消化　加入适量(盖满细胞面即可)0.25% 胰蛋白酶溶液，室温下(或 37℃)消化 2～3 分钟后，倒置显微镜下观察细胞面，待培养细胞变成圆形时即可快速倒去消化液(如消化程度不够时可延长时间);再加 Hanks 清洗液轻轻清洗一遍后倾出或直接进行下一步操作。如在酶消化过程中，见细胞大片脱落，表明消化过度，此时为避免细胞大量丢失，不应倒去消化液，而要加入等量的培养液吹打，收集细胞，800r/min 离心 5 分钟后弃去上清液，再进入下一步。

　　3. 接种　在培养瓶中加入 3 mL 培养液(含 10% 血清)以终止消化。用吸管反复吹打瓶壁上的细胞层，直到全部细胞被冲下，轻轻吹打混匀，制成单细胞悬液。按 1∶2 或 1∶3 分配，接种到 2～3 个培养瓶内，再向各瓶补加培养液到 5 mL，也可以取细胞悬液计数，分别按需要的细胞浓度接种到一定数量其他的培养瓶中，再补足培养液进行培养。原代培养的细胞首次传代时，细胞接种数量要多一些，以使细胞尽快适应新环境，利于细胞生存和增殖，随消化分离后的组织块也可一并传入新的培养瓶(图 5-2)。

　　4. 观察　细胞传代后，每天应对培养细胞进行观察，注意有无污染、培养液的颜色变化情况、细胞贴壁和生长情况等，若细胞贴壁存活则称为传代一次。

　　二、悬浮型生长细胞的传代

　　因悬浮型生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。

　　1、直接传代

　　直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉 1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。

　　2、离心传代

　　(1)在超净台内用吸管将培养瓶中的细胞吹打均匀，尤其是将半贴壁的细胞吹打起来。

　　(2)将细胞悬液吸入离心管中，盖紧胶盖，与另一离心管配平后，置离心机中 800～1000r/min 离心 5 分钟。

　　(3)回到超净台操作，弃上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打均匀，制成单细胞悬液。

　　(4)按 1∶2 或 1∶3 分配传代培养，也可以计数后根据所需要的细胞浓度传至已准备好的新培养瓶或培养皿中，放入 CO2 培养箱中继续培养。

　　细胞传代培养常见操作问题&解答

　　Q:贴壁细胞传代如何使用胰酶?

　　A：一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25%trypsin-0.53mMEDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin活性降低，并可减少污染机会。

　　Q:如何控制胰酶消化时间?

　　A：胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失;消化不足细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

　　不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度等有关。对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

　　Q:贴壁细胞如何进行传代?

A：去掉原培养瓶里面的培养基，加3-4ml PBS洗1-2次;弃PBS，再加1.5ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4ml左右完全培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min;弃上清，细胞沉淀用完全培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每瓶补足