通过TAL序列模块可组装识别任意DNA序列的模块化蛋白和重组核酸酶,在特定位点打断Knock-out、Knock-in碱基突变等修饰,能快速实现在细胞水平和动物水平对目的基因的修饰。
TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 技术是基于对DNA识别的TALEN臂和人工改造的核酸内切酶的切割域(FokⅠ)的结合对细胞基因组进行修饰而实现的。TALEN的DNA识别域是由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成,每个模块由34个氨基酸组成,其中第12和13位的氨基酸种类为可变的(RVDs),且决定了该模块识别靶向位点的特异性。通过DNA识别域结合到靶位点上,以及FokI的切割域形成二聚体后,可特异性对目标基因DNA实现切断。在非同源末端连接修复过程中,DNA双链断开后会由于碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。 该技术目前已成功应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类模式动物的研究领域。
1、设计、构建TALEN质粒
2、TALEN质粒体外转录成mRNA
3、mRNA原核显微注射(F0代小鼠生产)
4、F1代小鼠生产
1、完全性基因敲除鼠
TALEN完全性基因敲除是通过TALEN基因敲除技术,针对靶基因设计和构建TALEN质粒,造成目的基因的功能区域移码突变,获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的大小鼠模型。
2、基因敲入鼠
TALEN 基因敲入鼠是利用TALEN基因敲入技术,针对靶基因设计、构建TALEN质粒和donor vector,通过FOKI二聚体的切割作用和同源臂的同源重组,引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型) ;或将报告基因(如EGFP,mRFP,mCherry,mYFP,或LacZ等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点,从而可以通过报告基因来跟 踪目标基因的表达;也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因,使KO/KI同时发生。