基因敲除小鼠技术是指通过基因工程的方法使小鼠体内某种基因功能缺失的生物技术。它以基因靶向技术、小鼠ESC的分离和培养技术为基础。

　　基因敲除鼠的构建原理：

　　传统的基因打靶技术制备基因敲除(Knock out)/敲入(Knock in)小鼠是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。

　　同源重组是指当外源DNA片段与宿主基因组片段同源性高时，同源DNA区部分可与宿主DNA的相应片段发生交换(即同源重组)。

　　基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠，该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段，并已显示出巨大的应用前景及商业价值。

　　目前已有的基因敲除小鼠的技术：

　　一、常规基因敲除小鼠技术

　　制作基因敲除小鼠主要有两种方法：基因打靶和基因捕获。

　　1、基因打靶技术：基于成功的ESC培养和体外同源重组，在研究基因敲除引起小鼠基因组中功能丧失及突变方面较为常用。

　　2、基因捕获是作为基因靶向技术的替代方法而开发出来，它是一种高通量的和随机突变的技术，尽管不像基因靶向技术那样特异，但是通过诱捕可以在短时间内制作大量基因敲除小鼠。

　　二、条件基因敲除小鼠技术

　　条件基因敲除技术是指在小鼠发育的特定阶段或特定细胞组织类型中将目的基因进行敲除的技术。其本质是基于常规基因敲除技术，通过重组酶Cre对靶位点进行特异性重组，可以对小鼠的基因组修饰进行时间和空间上的调控。

　　1、 Cre/loxP系统

　　Cre/loxP系统已成为生物遗传操作的有力工具，几乎所有感兴趣的DNA序列都可以使用两端插入LoxP位点的方式来删除。Cre/loxP系统不仅可以删除目的基因，还可以特异性地激活目的基因表达。

集萃药康Cre/Dre工具鼠：由Cre重组酶介导的loxP位点的重组，在转基因、基因敲除、基因敲入模型动物方面得到广泛的应用，犹如一把基因“剪刀”，该系统可高效、便捷的在体内外进行DNA的各式“剪切”或者“再重组”，除了Cre重组酶，剪刀鼠家族还包括Flpo、Dre介导的FRT以及Rox位点的重组。cre基因

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　　2、CRISPR/Cas9系统

CRISPR介导的基因组编辑可以用于纠正与遗传性疾病相关的基因突变。

CRISPR/Cas9 KO策略示意图

集萃药康CRISPR/Cas9技术：通过CRISPR/Cas9技术制备特定基因修饰的小鼠模型。CRISPR/Cas9是目前最常用的基因编辑技术，可用于制备CKO/KO/KI/PM等类型基因编辑小鼠。

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　　三、其他基因敲除方法

　　1、 ZFN基因敲除技术

　　ZFN基因敲除策略主要有3个优点。首先该技术非常迅速，整个过程仅需要几个月。其次它在所有菌株中都有效果。第三，它不会导致外源DNA的掺入。由于ZFN技术可以通过多种重组方法进行切除后的DNA修复，与传统的基因敲除技术相比ZFN技术的敲除效率大大提升，但是由于ZFN技术存在脱靶这一亟待解决的问题，ZFN技术还不能完全取代传统的基因敲除小鼠技术。

　　2、TALEN基因敲除技术

TALENs技术由于操作的便捷性及较高的基因靶向特异性使得它成为基因工程的有力选择，迄今为止TALENs技术已被应用于不同物种的基因组编辑中，例如小鼠、酵母、水稻和玉米等。与ZFN技术相比，TALENs技术可以更加特异的识别目的基因并且不受其上下游序列的影响，但是与ZFN技术一样由于存在脱靶效应使得TALENs技术还不能完全取代传统的基因敲除技术。

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　　基因敲入小鼠代繁研究：

　　基因敲入可以在目的基因位置引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型) ;或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟 踪目标基因的表达。也可以用报告基因取代小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。

　　应用

　　1、用于药物筛选相关研究;

　　2、用于信号通路的研究;

　　3、用于示踪的相关研究。

　　基因敲除鼠公司代繁步骤周期：

　　1.打靶载体设计和构建(1-3月)

　　2.ES电转和阳性克隆筛选(2-3月)

　　3.ES显微注射和嵌合体制备(2-3月)

4.F1代小鼠繁殖和鉴定(2个月)

基因敲除鼠学术分享：

美国华盛顿大学医学院SYK敲除小鼠模型实验或为阿尔茨海默症免疫疗法提供新的选择https://www.gempharmatech.com/activity/article/0a82ed75-c7be-4dfd-bb96-b4f32aef61d2.html

western蛋白质检测：基因敲除小鼠模型出现蛋白条带原因分析https://www.gempharmatech.com/activity/article/3723f227-5215-484f-9b56-490d6ca6c0e5.html

　　文章引用：

　　王超玄, 孙航. 基因敲除小鼠技术的研究进展. 生物工程学报, 2019, 35(5): 784-794

　　Wang CX, Sun H. Progress in gene knockout mice. Chinese Journal of Biotechnology, 2019, 35(5): 784-794.